Текст доклада

1 слайд

Решающую роль в успешном лечении таких распространенных заболеваний, как онкологические, играет их ранняя диагностика и контроль эффективности лечения. В современной медицине ведутся работы по исследованию различных методов диагностики онкологических заболеваний. В настоящее время для этой цели применяется такая сложная дорогостоящая аппаратура, как, например, ЯМР-томограф. К сожалению, такая уникальная аппаратура, имеющаяся в единичных экземплярах в наиболее крупных медицинских центрах, не может обеспечить массовую профилактическую диагностику заболеваний на ранних стадиях их развития. Поэтому создание достаточно простых, недорогих, надежных и эффективных диагностических методов остается актуальной проблемой медицины.

Успешная разработка новых физических методов медицинской диагностики распространенных заболеваний, прежде всего онкологических, зависит от понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе патологии.

Так как развитие патологических процессов в организме, таких как онкологические заболевания, сопровождается изменениями ряда молекулярных параметров в клетках, тканях, а также сыворотке крови.

Цель работы: Обзор современных физических методов диагностики онкологических заболеваний и сравнение результатов полученных этими методами.

2 слайд

В настоящее время физические методы исследования биологических тканей и биологических жидкостей позволяют разработать диагностические методики для раннего обнаружения злокачественных новообразований. В этом случае требуется определить несколько независимых физических величин, таких как масса макромолекул, коэффициенты вращательной и трансляционной подвижностей, коэффициент межмолекулярного взаимодействия, сорбционные параметры заряженных ионов, взаимодействующих посредством сильного электростатического взаимодействия с поверхностью заряженных белков.

В данной работе проведен обзор трёх современных физических методов диагностики онкологических заболеваний. Это методы ядерного магнитного резонанса (ЯМР), электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и светорассеяния.

3 слайд

Метод статического светорассеяния

Метод исследований основан на измерении интегральной интенсивности рассеянного цвета. Анализ угловых и концентрационных зависимостей позволяет получить информацию о размерах рассеивающих центров, их молекулярной массе и втором вириальном коэффициенте. При конечных концентрациях всегда будет существовать межмолекулярное взаимодействие поэтому, согласно теории Дебая, интенсивность рассеянного света можно выразить через флуктуации концентрации, которые зависят от химического потенциала. В этом случае для разбавленных растворов макромолекул имеет место соотношение:

cHK / R₉₀ = 1 / M + 2 Bc...   (1)

где с – концентрация вещества в растворе; H – оптическая постоянная раствора; K – коэффициент определяемый оптической анизотропией рассеивающих частиц (фактор Кабанна); R₉₀  - рэлеевский коэффициент; M – молекулярная масса вещества в растворе; B – второй вириальный коэффициент.

Это уравнение позволяет измеряемую в эксперименте величину R₉₀ – рэлеевский коэффициент, или мутность, представить в виде вириального разложения по малым концентрациям.

Метод дает возможность прямого определения молекулярной массы M рассеивающих частиц, для чего необходимо измерить R₉₀  при нескольких концентрациях и экстраполировать полученную зависимость к концентрации c = 0. Тангенс угла наклона этой прямой, равный 2B, позволяет вычислить второй вириальный коэффициент B, характеризующий степень отклонения поведения раствора от идеального и служит мерой межмолекулярного взаимодействия.

Клинические данные показали, что все три параметра – интенсивность рассеяния, масса M и коэффициент взаимодействия B – различаются для пациентов с онкологическими заболеваниями и здоровых людей. В особенности заметное различие наблюдается в величине B. В случае онкологического заболевания B становится отрицательным, а масса рассеивающих частиц увеличивается. Следует отметить, что для больных с неонкологическими заболеваниями M и B также отличаются от соответствующих параметров сыворотки крови здоровых людей, но B при этом остается положительным.

4 слайд

Динамическое рассеяние света

Хаотическое броуновское движение дисперсных частиц или макромолекул вызывает микроскопические флуктуации локальной концентрации частиц. Результатом этих флуктуаций являются локальные неоднородности показателя преломления среды. При прохождении лазерного луча через такую среду часть света будет рассеяна на этих неоднородностях, что будет приводить к флуктуациям интенсивности рассеянного света в соответствии с флуктуациями локальной концентрации дисперсных частиц.

 Метод динамического рассеяния свет позволяет определить коэффициент диффузии дисперсных частиц в жидкости путем измерения характерного времени флуктуаций интенсивности рассеянного света.

 5 слайд

 Информация о коэффициенте диффузии частиц может быть получена из автокорреляционной функции сигнала рассеянного света. Автокорреляционная функция описывает связь между сигналом в момент времени τ и τ + dτ согласно определению имеет следующий вид:

G(t)=⟨I(t)I(t + τ)⟩   (2)   

Данный метод определения корреляционной функции фотонов называется методом корреляции фотонов или фотонно – корреляционной спектроскопии (ФКС).

Корреляционная функция сигнала в простейшем случае монодисперсного раствора, содержащего невзаимодействующие сферические частицы одного размера, имеет вид экспоненты со временем релаксации τ_rel = 1/ D_t q²:

g1 (τ) = exp(-D_t q²τ)   (3)

          q – волновой вектор флуктуации концентрации, определяется формулой

q =  sin    (4)

где n – показатель преломления среды,  длина волны рассеянного света в вакууме, угол рассеяния.

Таким образом, коэффициент диффузии частиц обратно пропорционален обратному времени релаксации флуктуаций интенсивности рассеянного света. Это характерное время в свою очередь, есть время затухания экспоненциальной корреляционной функции рассеянного света, которая измеряется с помощью цифрового коррелятора.

Коэффициенты диффузии заряженных и нейтральных молекул могут различаться согласно формуле:

D_t = D₀{1 + (2BM - [η]c)}   (5)

Где D₀ – коэффициент диффузии в изоэлектрической точке, B – вириальный коэффициент межмолекулярного взаимодействия, c – концентрация раствора, M – молекулярная масса, [η] – характеристическая вязкость, зависящая от электростатического взаимодействия. В  формуле (5) зависимость коэффициента диффузии от зарядового состояния молекулы в явном виде отсутствует, однако коэффициент B и характеристическая вязкость [η] являются функциями электростатических параметров молекул, что обуславливает зависимость D_t от поверхностного заряда макромолекул.

6 слайд

Рис.1 иллюстрирует различия светорассеяния в сыворотке крови здоровых и больных пациентов. Как можно видеть, наблюдается четкое пространственное разделение точек, относящихся к случаям онкологических больных и здоровых людей. Результаты, относящиеся к группе риска, локализуются вблизи линии B=0.

Наиболее вероятно, что появление онкологического заболевания или предрасположенности к нему – результат изменения поверхностного заряда на молекулах белков. С уменьшением заряда кулоновские силы отталкивания между молекулами протеинов ослабевают и силы дипольного притяжения между ними начинают превалировать. Это приводит к изменению величины и знака коэффициента взаимодействия B и к образованию комплексов молекул, обладающих массой большей, чем у отдельных протеинов. Этот вывод был подтвержден с помощью исследований модельных систем – растворов смесей белков взятых в разных пропорциях. Исследования показали, что знак параметра межмолекулярного взаимодействия B зависит от соотношения концентраций альбумина и γ-глобулина. При увеличении содержания γ-глобулина в растворе по сравнению с альбумином концентрационные зависимости параметра рассеяния становятся отрицательными.

На рисунке 2 представлена зависимость коэффициента B рассеивающих центров от значений pH в исследуемых растворах. Видно явное отличие положения кривых для модельных растворов «больной» и «здоровой» крови, при этом различие не только в знаке коэффициента B, но и в положениях минимума. Минимум зависимости от pH для модельного раствора сыворотки «здоровой» крови наблюдается при pH ≈ 4.9, что соответствует изоэлектрической точке альбумина; для модельного раствора «больной» крови при pH ≈ 6, что соответствует изоэлектрической точке гамма-глобулина, и для модельного раствора сыворотки крови «группы риска» при pH ≈ 5.

7 слайд

На рисунке 3 и 4 представлена зависимость коэффициента трансляционной диффузии  D_t  рассеивающих центров от значений pH и от концентрации белков в исследуемых растворах.

Графики зависимостей D_t(c) на рисунке 3 для модельных растворов имеют разный тангенс угла наклона. Наклон зависимости D_t(c) для модельного раствора сыворотки «здоровой» крови определяется наклоном D_t(c)  для раствора альбумина. Для модельного раствора «больной» крови характер зависимости задает гамма-глобулин.

Такие отличия кривых на рисунках 3, 4 и 5 связаны с преобладанием белка альбумина в модельном растворе сыворотки «здоровой» крови и преобладанием гамма-глобулина в модельном растворе сыворотки «больной» крови.

8 слайд

Метод ЯМР

Метод ЯМР используется в науке уже много лет, и он зарекомендовал себя как удобный, быстрый и точный способ обнаружения содержания протонов в растворах. Он позволяет по времени релаксации сигнала определить не только спектр, но и молекулярную подвижность, а также молекулярную сорбцию.

Для диагностических целей часто оказывается достаточным измерить только один релаксационный параметр, например T₁ . Величина T₁  заметно отличается для случаев здоровых пациентов и онкологических больных.

9 слайд

Однако, как видно из рис. 1, статистические данные по параметру T₁ для этих двух групп имеют значительное перекрытие, порядка 70–80 %, что делает неприемлемым использование методики в качестве достоверной диагностики.

При этом если измерять не абсолютное значение параметра T₁ , а его изменение ΔT₁ при добавлении малых концентраций парамагнитных солей в плазму крови, то оно будет иметь разный знак в случаях здоровых людей и онкологических больных.

10 слайд

Метод ЭПР

Метод ЭПР, подобно методу ЯМР, позволяет определить сорбционные параметры белка, а также его вращательную молекулярную подвижность. Для наблюдения сигнала ЭПР белка в раствор вводят специальный парамагнитный зонд, который прочно связывается с поверхностью белковой макромолекулы. В рассмотренных исследованиях использовался зонд, который хорошо связывается с липидной зоной белка альбумина.

На рисунке 7 приведен типичный спектр ЭПР для раствора альбумина.

Основным параметром является коэффициент β = I_A/I_B, который характеризует сорбционные свойства иминоксильных радикалов в липидной зоне альбумина. Он рассчитывается как отношение амплитуды левой линии спектра ЭПР, характеризующей связывание радикала с белком (величина I_A ), к амплитуде узкой правой линии, которая показывает концентрацию несвязанного зонда в растворе (величина I_B ).

При онкологическим поражении происходит свободнорадикальное окисление липидов и парамагнитный зонд выталкивается на поверхность. При этом величина сигнала I_B возрастает, а коэффициент  β уменьшается.

11 слайд

На рисунке 8 приведены кривые сорбции в координатах Скэтчарда. На этом рисунке показано отношение количества связанного зонда С_связ и количества введенного в раствор зонда С_зонд, деленного на концентрацию белка в растворе С_белок. При этом параметр горизонтальной оси является безразмерным и характеризует число центров связывания зонда на белке. При онкологическом поражении эта величина уменьшается в несколько раз.

Другим независимым параметром, используемым для диагностики, является величина γ = tgϕ/ΔH₀, которая определяется из графика зависимости ширины центральной линии ЭПР от концентрации плазмы крови, примеры которой приведены на рисунке 9. Из графиков видно, что параметр γ отличается в норме почти в два раза по сравнению с онкологией.

12 слайд

На двухпараметрическом графике (рис. 10) видно четкое разделение областей параметров β и γ, которые мало коррелированны между собой, поскольку характеризуют разные физические молекулярные параметры белков плазмы, а именно вращательную подвижность и процесс сорбции липофильных ЭПР зондов.

 13 слайд

Все три метода рассмотренные в данной работе метода могут быть успешно использованы для диагностики онкологических заболеваний.

Метод светорассеяния при этом является наиболее перспективным для целей диагностики, так как является сравнительно недорогим, позволяет определить параметры образца за время порядка минуты и не требует большого количества сыворотки крови. В перспективе метод может быть применен как в онкологических центрах так и в поликлиниках.